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近日，中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院藻類生物技術(shù)與遺傳育種實(shí)驗(yàn)室隋正紅教授團(tuán)隊(duì)在龍須菜基因編輯體系構(gòu)建方向取得重要進(jìn)展，研究成果“CRISPR/LbCas12a-mediatedtargetedmutationofGracilariopsislemaneiformis（CRISPR/LbCas12a介導(dǎo)的龍須菜靶基因突變）”在線發(fā)表于植物學(xué)知名期刊PlantBiotechnologyJournal。文章首次報道了在紅藻龍須菜中基于CRISPR/LbCas12a基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的突變，該研究也為大型海藻基因編輯技術(shù)體系構(gòu)建提供了重要參考。

龍須菜是一種重要的大型經(jīng)濟(jì)海藻，是瓊膠的主要原材料和鮑魚的餌料，但是目前缺乏對龍須菜進(jìn)行遺傳改造的技術(shù)手段，限制了龍須菜的高效育種開發(fā)。由于大型海藻特殊的生物學(xué)特性，目前尚未有成功實(shí)現(xiàn)基因編輯的報道。為了解決這一難題，研究團(tuán)隊(duì)制定了通過基因槍轉(zhuǎn)化Cas12a蛋白與gRNA復(fù)合體的方案，大大簡化了實(shí)驗(yàn)流程。CRISPR/LbCas12a系統(tǒng)是一種高效的基因編輯手段，目前已經(jīng)成功地應(yīng)用于多個物種中，實(shí)現(xiàn)了基因敲除、激活或抑制。研究團(tuán)隊(duì)在大型海藻龍須菜中實(shí)現(xiàn)CRISPR/LbCas12a基因編輯，為龍須菜的基因功能研究提供了重要的技術(shù)手段，對遺傳育種具有重要意義。

該研究首先針對龍須菜的一種胞外碳酸酐酶基因設(shè)計了6個靶位點(diǎn)，并在體外驗(yàn)證了針對這6個靶位點(diǎn)的gRNA效率。在這6個靶位點(diǎn)中挑選了兩個效率最高的gRNA，并將它們分別與LbCas12a蛋白孵育形成蛋白質(zhì)核酸復(fù)合體（RNP），使用基因槍分別將各RNP轟擊轉(zhuǎn)化進(jìn)龍須菜藻尖中。培養(yǎng)5天后，PCR擴(kuò)增碳酸酐酶基因，通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）將疑似突變的片段富集后進(jìn)行單克隆測序，檢測到了發(fā)生在靶位點(diǎn)附近的堿基替換結(jié)果。為了能夠直觀地區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞和正常細(xì)胞，該研究又選擇了藻紅蛋白的γ亞基作為靶基因。針對每一個藻紅蛋白的γ亞基基因，分別設(shè)計了兩個靶位點(diǎn)并進(jìn)行體外效率驗(yàn)證。將所有靶位點(diǎn)中效率最高的一個gRNA與Cas12a蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)入到龍須菜藻尖中。5天后，在熒光顯微鏡下觀察到了龍須菜藻體表面轉(zhuǎn)化細(xì)胞的自發(fā)熒光發(fā)生改變，形成了區(qū)別于正常細(xì)胞的“色斑”。通過單克隆測序檢測到了靶位點(diǎn)附近的堿基替換及靶位點(diǎn)上游的堿基插入和缺失。

中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院張敬宇、吳瓊及MorganeEléou?t博士為論文的共同第一作者，隋正紅教授和胡依依博士為共同通訊作者。這項(xiàng)工作得到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和財政部國家藻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的資助。

通訊員：王志剛